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酶標儀測定的原理是在特定波長下，檢測被測物的吸光值。光通過被檢測物，前后的能量差異即是被檢測物吸收掉的能量，特定波長下，同一種被檢測物的濃度與被吸收的能量成定量關系。檢測單位用 OD 值表示，OD 是 optical delnsity（光密度）的縮寫，OD＝1og（1/trans），其中 trans 為檢測物的透光值。根據(jù)蘭伯—比爾定律，OD值與光強度成下述關系：E＝OD=logΙ0/Ι，其中：E 表示被吸收的光密度；Ι0 為在檢測物之前的光強度；Ι 為從被檢測物出來的光強度。OD 值由下述公式計算：E＝OD=C×D×E 其中：C 為檢測物的濃度；D 為檢測物的厚度；E 為摩爾因子。

酶標儀：即酶聯(lián)免疫檢測儀（ELISA Reader）是酶聯(lián)免疫吸附試驗的儀器。可簡單地分為半自動和全自動兩大類，但其工作原理基本上都是一致的，其核心都是一個比色計，即用比色法來分析抗原或抗體的含量。ELISA 測定一般要求測試液的終體積在250ul 以下，用一般光電比色計無法完成測試。因此對酶標儀中的光電比色計有特殊要求。

ELISA 實驗原理：用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗體的微孔中依次加入標本或者標準品、生物素化的抗體，HRP 標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物顯色。底物在過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺和樣品中的目標蛋白呈正相關。用酶標儀在（450nm）波長下測定測定吸光度，計算樣品濃度。

1.1 酶標儀測糧食中的黃曲霉毒素含量儀器、試劑①美國熱電 MK3 型酶標儀；賽多利斯電子天平（感量 0.1 克）；50 微升移液器及配套吸頭；恒溫培養(yǎng)箱（0℃-50℃）；冰箱（4℃-8℃）；玻璃器皿：錐形瓶，燒杯，分液漏斗，蒸發(fā)皿，量筒，具塞試管，滴管，移液管；濾紙等。②黃曲霉毒素 Bl 酶聯(lián)免疫定量測試盒；石油醚；甲醇；蒸餾水。

1.2實驗步驟

1.2.1樣品處理方法：稱5.0g樣品（已粉碎）于100ml具塞三角瓶中。準確加入 25.0ml 甲醇水（1+1）溶液，加塞振搖 15min，棄去 1/4初濾液，收集試樣濾液，此液為樣品提取液。假設樣品不需稀釋，此液則為待測樣液。

1.2.2試劑的配制①每瓶C試劑（酶標抗原）中準確加入1.5mlD試劑(酶標抗原稀釋液)，充分溶解，配成實驗用酶標抗原溶液，2℃——8℃保存。②取適量 E 試劑（濃縮洗滌液）用蒸餾水稀釋 20 倍待用。

1.2.3操作流程：樣品提取，適當稀釋，試劑準備，加樣，在溫度37℃下進行免疫反應30min，然后在37℃下進行顯色反應15min，結果判定，計算含量。

2 結果計算

建立公式：X（ng/g）=C×VM×D式中：X：黃曲霉毒素B1含量（ng/g）；C：待測樣液中黃曲霉毒素Bl含量（ng/m1）；V：樣品提取液體積（m1）；M：樣品質量（g）；D：樣品稀釋倍數(shù)。

3 酶標儀的使用注意事項

3.1 工作環(huán)境 酶標儀是一種精密的光學儀器，因此良好的工作環(huán)境不僅能確保其準確性和穩(wěn)定性，還能夠延長其使用壽命。

①儀器應放置在無磁場和干擾電壓的位置。

②儀器應放置在低于 40 分貝的環(huán)境下。

③為延緩光學部件的老化，應避免陽光直射。

④操作時環(huán)境溫度應在 15℃——40℃之間，環(huán)境濕度在 15％——85％之間。

⑤操作電壓應保持穩(wěn)定。

⑥操作環(huán)境空氣清潔，避免水汽，煙塵。保持干燥、干凈、水平的工作臺面，以及足夠的操作空間。

3.2 操作注意事項 酶標儀的功能是用來讀取酶聯(lián)免疫試劑盒的反應結果，因此要得到準確結果，試劑盒的使用必須規(guī)范。在酶標儀的操作中應注意以下事項：①使用移液器加液，移液頭不能混用。②洗板要洗干凈。如果條件允許，使用洗板機洗板，避免交叉污染。③嚴格按照試劑盒的說明書操作，反應時間準確。④請勿將樣品或試劑灑到儀器表面或內部，操作完成后請洗手。⑤如果使用的樣品或試劑具有污染性、毒性和生物學害，請嚴格按照試劑盒的操作說明，以防對操作人員造成損害。⑥不要在測量過程中關閉電源。⑦對于因試劑盒問題造成的測量結果的偏差，應根據(jù)實際情況及時修改參數(shù)，以達到佳效果。⑧使用后蓋好防塵罩。

3.3 閾值可疑范圍的設定 一般酶標儀閾值矩陣設定可設定陰性、可疑、陽性 3 個范圍。有經(jīng)驗表明可疑范圍的設定要設定為臨界上下15%（也稱灰色區(qū)）為宜；同時陰性范圍下限和陽性范圍應該充分考慮到影響 ELISA 結果因素的存在，可疑范圍上限必須考慮到雙波長情況下出現(xiàn)負吸光度值和超范圍報告影響結果的可能性。“灰色區(qū)”的結果的真實性是 ELISA 定性測定中需要把握的環(huán)節(jié)，也是實驗室引起醫(yī)療糾紛的主要方面，因此必須對可疑結果進行復檢，用兩種試劑盒。

3.4 樣本名字文件設定 由于部分試驗的所測樣本不一定是連續(xù)，樣本命名顯得尤為重要。同時應做到樣本名字文件與吸光度值文件保持一致，這樣若以后再調出吸光度文件時，樣本名字文件可自動同時調出；若大批量樣本時應對不同微孔板編號區(qū)別（以文件后綴形式）。

3.5 樣板程序文件設定 一個實驗室同一試驗可能使用不同廠家試劑盒，但不同試劑盒規(guī)定的設定對照數(shù)量、閾值判定標準等均可能不一致，酶標儀所設樣板程序也不一致。為了使用方便，可在樣板程序文件中用后綴加以區(qū)別。

3.6記錄管理 隨著我國法律的不斷完善，人們的法制觀念不斷增強，建立健全原始記錄十分重要和必要。原始記錄不僅是儀器打印出來的數(shù)據(jù)，還應記錄試劑盒廠家、批號、效期、質控物來源、批號、效期、檢測者、復核者等相關內容，同時可用原始記錄進行資料分析，更好地開展工作。但要注意的是原始記錄不宜保存在電腦內，應打印后裝訂保存。